Caracterización de las infecciones causadas por flavivirus: diagnóstico diferencial, biomarcadores y respuesta intracelular UACM/SS/8266/INT (Interno)

Objetivo General

Caracterizar las infecciones ocasionadas por flavivirus con la finalidad de establecer ensayos para el diagnóstico diferencial, determinar biomarcadores de enfermedad grave así como conocer la respuesta intracelular a la infección como estrategia para el diseño racional de antivirales.

Justificación

Las enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes, tales como las causadas por flavivirus son un problema de salud pública en México y en el mundo. Dengue (DENV) y Zika (ZIKV) son flavivirus que pertenecen a los virus transmitidos por artrópodos siendo "Aedes aegypti" el principal vector de la infección. Dichos virus se mantienen en la naturaleza en un ciclo infeccioso en el que los mosquitos hembra se alimentan de la sangre de un humano infectado y de esta manera adquieren el virus que transmiten al picar a un individuo no infectado. La infección por DENV puede ser asintomática o producir síntomas que van desde una enfermedad febril leve a moderada hasta un síndrome hemorrágico grave que puede causar la muerte. En el caso de ZIKV las complicaciones se dan principalmente en mujeres embarazadas que transmiten la infección al feto, de manera que el neonato presenta un síndrome congénito asociado a malformaciones y defectos a nivel neurológico que producen anomalías motoras, visuales, del habla, cognitivas entre otras. En nuestro país circulan los 4 serotipos de DENV desde hace varias décadas y se tienen registros de la infección por ZIKV desde el 2015, por lo que el diagnóstico diferencial, la búsqueda de biomarcadores tempranos de enfermedad grave así como la comprensión de los procesos de la respuesta intracelular a la infección nos pueden ayudar a disminuir las consecuencias graves de la infección mediante un diagnóstico preciso y temprano, manejo adecuado de los pacientes, estrategias de control y desarrollo de antivirales.

Desarrollo

A) Las investigaciones desarrolladas en el laboratorio acerca del estudio de los flavivirus nos han dado a conocer varios candidatos para el desarrollo de un diagnóstico que permita diferenciar a los pacientes infectados con DENV o ZIKV. Por lo anterior, las actividades a desarrollar consisten en probar distintos ensayos usando anticuerpos monoclonales (generados previamente) con los cuales se buscará el reconocimiento específico de cada uno de los virus para su posterior uso como una valiosa herramienta para el diagnóstico diferencial. Los ensayos que se llevarán a cabo son cultivo celular, ensayos de infección, western blot, citometría de flujo, ELISA, inmunofluorescencia, entre otros.
B) En el caso de la búsqueda de biomarcadores de enfermedad grave por DENV hemos encontrado varias moléculas de RNA en suero como potenciales biomarcadores. Las actividades a realizar incluyen análisis “in silico” para determinar las vías con las que dichos RNAs se podrían relacionar y así determinar también sus probables implicaciones en la patogénesis de la enfermedad. Adicionalmente se requiere llevar a cabo ensayos de extracción de ácidos nucleicos, RT-PCR en tiempo real, análisis estadístico de los resultados, entre otros.
C) Para la caracterización de la respuesta intracelular a la infección, uno de nuestros principales intereses es el papel de los miRNAs en la patogénesis de la infección. A la fecha se tienen varias moléculas de miRNAs que encontramos moduladas durante la infección, las cuales se estudiarán para determinar su implicación en la respuesta inmune, estrés oxidativo y apoptosis. Las actividades iniciarán con el análisis “in silico” para encontrar las probables vías relacionadas con la función de dichos y así conocer las posibles maneras en las que inciden en la patogénesis de la enfermedad. Posteriormente se deberán llevar a cabo ensayos en líneas celulares que permitan conocer el papel de los miRNAs como parte de la respuesta intracelular a la infección y si es el caso proponerlos como blancos de terapias antivirales. Las actividades a realizar incluyen cultivo celular, extracción de ácidos nucleicos, RT-PCR en tiempo real, transfección de miRNAs, ensayos de viabilidad celular, western blot, microscopía de fluorescencia, entre otros.

Recursos

En la primera parte de la investigación no se requieren recursos debido a que el análisis “in silico” se llevará a cabo usando herramientas bioinformáticas disponibles de manera gratuita.
Para los ensayos "in vitro" se requieren recursos que se han considerado para el programa operativo anual de la UACM y se planea someter el presente proyecto a convocatorias externas como las de CONACyT.

Evaluación

La evaluación del desempeño de los prestadores de servicio se realizará mediante informes de los avances que se deberán presentar periódicamente en tiempo y forma. Adicionalmente llevarán a cabo revisiones de la literatura publicada al respecto y se realizarán presentaciones acerca del estado del arte del tema de estudio, las cuales también serán tomadas en cuenta en la evaluación.

Resultados

Los resultados que se esperan del presente proyecto son el establecimiento de ensayos que permitan el diagnóstico diferencial de DENV y ZIKV, determinar biomarcadores de RNA en suero que nos ayuden en la predicción temprana de enfermedad grave así como conocer la respuesta intracelular a la infección, especialmente la dependiente de miRNAs, como estrategia para el diseño racional de antivirales.

Actividades	Licenciatura	Solicitados
a) Apoyar en los análisis "in silico" que servirán para determinar las vías en las que los potenciales biomarcadores de RNA podrían estar participando. Los resultados nos pueden indicar mecanismos de patogénesis de los flavivirus en las personas con infección grave. b) Colaborar en el análisis "in silico" para encontrar a los probables RNA mensajeros blancos de los miRNAs (y las vías en las que inciden) relacionados con el estrés oxidativo, respuesta inmune y apoptosis que se producen durante la infección con los flavivirus. Lo anterior nos ayudará a encontrar blancos potenciales para la generación de antivirales. c) Auxiliar en el desarrollo de los ensayos de cultivo celular, infección, transfección de miRNAs y extracción de ácidos nucleicos, western blot, inmunofluorescencia y citometría de flujo. Dichas metodologías nos permitirán conocer los efectos de los miRNAs en el estrés oxidativo, respuesta inmune y apoptosis durante la infección por los flavivirus. d) Participar en la realización de análisis estadísticos de los resultados obtenidos en el presente estudio y en estudios previos generados por el laboratorio. Este tipo de actividades permitirá la organización y análisis matemático de los datos obtenidos para llegar a conclusiones mas acertadas.	Ciencias Genómicas	3